본 논문의 저자들은 개의 가장 중요한 tumor suppressor gene 중 하나 인 tumor protein 53 (TP53)을 타겟으로 하는 최적의 CRISPR/Cas9 시스템을 개발하고, 암 연구에 활용가능한 TP53이 knockout된 canine cell을 제작하였다. 이를 위해 TP53을 타겟으로 하면서도 off-target effect를 최소한으로 유발하는 3종의 sgRNA를 이용해 CRISPR/Cas9 vector를 구성하였다. 이후 해당 vector를 transfection한 뒤 무한한 세포 수명, 유전 독성에 대한 내성, 불안정한 genomic status에 관여하는 목적 locus에 indel mutation을 포함하는 몇몇 clone을 얻었다.
제작한 TP53 knockout 세포 중, TP53 gDNA #30번으로 knockout된 세포 (TP53KO#30)는 in vitro와 in vivo 모두에서 oncogenic activation 없이 non-cancerous phenotype을 나타냈을 뿐 아니라, off-target mutation을 보이지 않았다. 또한 TP53KO#53 세포에서 체세포 핵 이식 기술을 적용한 후 발달 능력을 확인하였다.
본 논문은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 canine cell에서의 TP53이 효과적이고 특이적으로 표적화 되었음을 확인하였고, CRISPR/Cas9을 이용한 TP53 knockout cell이 항암 치료제 개발을 위해 새로운 oncogenic function과 효과를 밝히는 유용한 플랫폼이 될 수 있음을 보여준다.
